Pada akhir 1980-an, sebagai lanjutan Namun, mikroskop confocal laser memiliki cacat utama: bukaan confocal tidak hanya memblokir fluoresensi yang dihasilkan di luar titik fokus, tetapi juga memblokir fluoresensi yang dihasilkan oleh titik fokus yang tersebar oleh jaringan biologis, mengakibatkan penurunan efisiensi pengumpulan fluoresensi, dan kedalaman pencitraan tidak boleh lebih dari 100 mikrometer. Oleh karena itu, pada 1990-an, mikroskop fluoresensi dua foton yang menggabungkan mikroskop confocal laser dan teknologi eksitasi dua foton muncul. Panjang gelombang eksitasi dari proses penyerapan dua foton umumnya diatur dalam rentang jendela bio-optik 680-1080 nm, yang menghindari kerusakan sinar ultraviolet pada sel atau organisme hidup dan menembus lebih dalam.
Saat ini, mikroskop fluoresensi dua foton yang paling banyak digunakan adalah laser batu permata titanium femtosecond, yang besar dan mahal, yang membatasi penerapan mikroskop fluoresensi dua foton di berbagai bidang seperti ilmu kehidupan, kimia, dan kedokteran. Jadi di beberapa bidang seperti diagnostik medis, orang telah mencoba menggunakan laser solid-state sub-nanosecond yang ringkas dan terjangkau sebagai sumber cahaya standar.
Prinsip dasar eksitasi dua foton adalah bahwa, ketika molekul fluoresen tereksitasi di bawah kerapatan foton tinggi, ia secara bersamaan menyerap dua foton dengan panjang gelombang panjang, dan kemudian secara spontan memancarkan foton fluoresen kembali ke keadaan dasar setelah lompatan eksitasi dan proses relaksasi. Dibandingkan dengan mikroskop fluoresensi eksitasi foton tunggal konvensional, pembangkitan sinyal optik dalam mikroskop fluoresensi eksitasi dua foton bersifat nonlinier, dengan cahaya eksitasi menjadi sumber cahaya dengan panjang gelombang lebih panjang, daya puncak lebih tinggi, dan foton fluoresen yang dipancarkan memiliki panjang gelombang sedikit lebih panjang dari setengah panjang gelombang eksitasi.
Mikroskopi Fluoresensi Dua Foton menggunakan sumber cahaya laser inframerah-dekat, dan sifat nonliniernya tidak memerlukan apertur confocal. Oleh karena itu, dibandingkan dengan mikroskop confocal, mikroskop fluoresensi dua foton memiliki keuntungan sebagai berikut:
- Kedalaman pencitraan besar dan kerusakan optik rendah;
- Tidak diperlukan bukaan confocal, dan efisiensi pengumpulan fluoresensi sangat ditingkatkan;
- Resolusi dan kontras spasial yang lebih tinggi;
- Kisaran eksitasi kecil, fototoksisitas kecil dan pemutihan;
- Panjang gelombang emisi dan eksitasi berjauhan, menghindari tumpang tindih spektral;
